Your address will show here +12 34 56 78
Ovucheck®


Een vergelijking tussen de Ovucheck® Plasma progesteron ELISA en de Immulite® progesteron chemiluminescentie enzym immunoassay.

C.J. van der Meiden 
 
 (Met toestemmimg van dhr. H. De Cortie, A. Menarini Diagnostics)

Samenvatting

De plasma progesteron concentratie is een goede parameter om het optimale dektijdstip van de loopse teef te bepalen. Er zijn diverse testkits in de handel voor, meestal kwalitatieve, progesteronbepaling in de praktijk. In dit onderzoek is van 25 plasmamonsters van loopse teven de progesteronconcentratie kwantitatief bepaald met de Ovucheck® Plasma testkit en gelijktijdig met de Immulite® progesteron chemiluminescentie immunoassay. Tussen deze methoden werd een correlatiecoëfficiënt gevonden van 0,967. 
Geconcludeerd wordt dat de Ovucheck® Plasma progesteron testkit een goede correlatie vertoont met de Immulite® wat deze kit bruikbaar maakt om progesteron te meten met de bedoeling het optimale dektijdstip te bepalen. Er moet bij de interpretatie wel rekening mee gehouden worden dat de met de Ovucheck® verkregen concentraties duidelijk hoger bleken dan de concentraties die zijn bepaald met de chemiluminescentie methode.

Inleiding

In de fokkerij van de hond is het van belang dat de loopse teef op het optimale moment tijdens de loopsheid gedekt wordt. Niet alleen wordt de kans op drachtigheid hiermee vergroot, ook de nestgrootte wordt hierdoor positief beïnvloed (1).


Uit diverse onderzoeken is gebleken dat het bepalen van het optimale dektijdstip aan de hand van het gedrag van de teef onbetrouwbaar is en datzelfde geldt voor lichamelijke symptomen als uitvloeiing en vulvazwelling (2,3,4). Ook de methode van veel  fokkers om de teef standaard op een bepaald aantal dagen, meestal 11 tot 13,   na het begin van de loopsheid te laten dekken is af te raden omdat dit voorbij gaat aan de grote variatie die bestaat tussen teven maar ook tussen cycli. Volgens sommigen is verkeerde timing van de dekking zelfs de belangrijkste oorzaak voor het niet drachtig worden van een gedekte teef.


Met behulp van cytologisch onderzoek van vagina-uitstrijkjes is het stadium van de cyclus te bepalen. Onder invloed van de stijgende oestrogeenconcentratie tijdens de pro-oestrus zal cornificatie van de oppervlakkige cellagen van het vaginaslijmvlies optreden. Omdat deze cornificatie pas 5 dagen na de ovulatie verdwijnt, heeft de vaginacytologie echter slechts retrospectieve waarde als het gaat om het vaststellen van het moment van ovulatie (5,6).


Een vaste relatie blijkt te bestaan tussen het optreden van de LH piek en de ovulatie. Het interval tussen de pre-ovulatoire LH-piek en de ovulatie bedraagt ongeveer 2 dagen zodat bepaling van dit hormoon een goede methode is om de eisprong te voorspellen. Een praktisch bezwaar is echter dat de LH-piek slechts kort duurt waardoor het onderzoek dagelijks gedaan zal moeten worden. Verder beschikken maar weinig laboratoria over een betrouwbare assay voor de bepaling van het canine LH.


Volgens diverse onderzoekers is de progesteronconcentratie van het plasma een betrouwbare methode om de ovulatie te voorspellen (4,5,8). Vanwege het feit dat bij de teef sprake is van een pre-ovulatoire luteinisatie begint de stijging van de progesteronconcentratie al 2 dagen voor de ovulatie. Diverse onderzoekers hebben aangetoond dat het ovulatietijdstip kan worden bepaald door eenmaal per twee dagen de progesteronconcentratie van het bloed te bepalen (9,10,11).


Tijdens de anoestrus is de progesteronconcentratie, bepaald met de Radio Immuno Assay (RIA), minder dan 1,0 ng/ml. Ook tijdens het grootste gedeelte van de pro-oestrus ligt het progesteron op dit basale niveau. Op de dag van de LH-piek zal de progesteronconcentratie, als gevolg van de pre-ovulatoire luteinisatie van de follikels, gaan stijgen tot ongeveer 2,0 ng/ml. Een dag later stijgt het progesteron door tot 3,0 ng/ml. om op de dag van ovulatie een niveau te bereiken van 4,0 tot 8,0 ng/ml. Hogere progesteron concentraties geven aan dat de eisprong inmiddels heeft plaatsgevonden.


De oocyten van de teef zijn op het moment van ovulatie nog in een immatuur stadium. Deze “primaire oocyten” kunnen op dat moment ook nog niet bevrucht worden. Bevruchting is pas mogelijk vanaf 60 uur na de ovulatie, wanneer het maturatieproces voltooid is. Het optimale dektijdstip voor de teef is ongeveer twee dagen na de ovulatie (10).


Progesteron kan betrouwbaar bepaald worden met een 125Jodium-radio-immunoassay (12) en met chemiluminescentie (17, 18). Beide methoden zijn voor dierenartsenpraktijken waar geen grote aantallen monsters op progesteron onderzocht worden, niet geschikt vanwege hoge investerings- en onderhoudskosten. Voor de RIA komt daar nog bij dat gekwalificeerd laboratoriumpersoneel en een vergunning voor het werken met radio actieve isotopen nodig zijn. Het opsturen van bloed naar een extern laboratorium betekent echter vertraging en is tijdens het weekeinde meestal niet mogelijk. Om die reden zijn er diverse kits in de handel waarmee de progesteronconcentratie, kwalitatief, in de praktijk bepaald kan worden. Deze testen geven meestal aan of de progesteronconcentratie laag, gemiddeld of hoog is. Over de nauwkeurigheid van deze kits voor klinisch gebruik wordt in de literatuur verschillend geoordeeld. Volgens sommige onderzoekers zijn dergelijke testen goed bruikbaar om in de praktijk het ovulatietijdstip vast te stellen (15). In een onderzoek van Van Klaveren et al (16) waarbij 3 kwalitatieve ELISA testkits onderzocht werden op klinische betrouwbaarheid wordt echter de conclusie getrokken dat deze kits te onnauwkeurig zijn voor het bepalen van de optimale dekperiode.

 

De Ovucheck® Plasma is een ELISA testkit waarmee de progesteronconcentratie kwantitatief  bepaald kan worden van 0,5 tot 10,0 ng/ml. Het doel van dit onderzoek was het vergelijken van de uitslagen van de Ovucheck® met de concentraties verkregen met de Immulite® chemilumenescentie immuno assay.

Materiaal en methode

Gedurende de maanden januari en februari 2005 zijn bloedmonsters afgenomen bij teven die uitwendige verschijnselen vertoonden van loopsheid. De monsters werden afgenomen in Lithium-heparine-buizen en direct na afname gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 1500 toeren per minuut. Het plasma werd vervolgens afgepipetteerd, verdeeld over twee Eppendorf containers en ingevroren en bewaard bij -28 graden Celsius.


Nadat op deze wijze van 23 honden 2 plasmamonsters waren verzameld is van alle teven een monster verstuurd naar het SHL voor progesteronbepaling met de Immulite®2000 (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles) en is op dezelfde dag in het laboratorium van Dierenkliniek Van der Meiden het progesteron bepaald met de Ovucheck Plasma® (Biovet, Canada). Om concentratieverschillen vanwege temperatuursinvloeden te voorkomen zijn op de testdag ’s ochtends alle monsters uit de vriezer genomen en zijn de monsters voor het SHL verpakt in een koelbox (2 – 6 C) en per koerier naar het SHL vervoerd. De overige monsters zijn die dag bewaard in de koelkast. Om 15.00 uur die dag zijn beide sets gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geplaatst, waarna de bepalingen uitgevoerd zijn.

De Ovecheck® Plasma

De Ovucheck® Plasma is een immunoassay die gebaseerd is op de competitieve binding van progesteron en progesteronmoleculen die gelabeld zijn met het enzym Alkalische Fosfatase (AP).


De binding vindt plaats in, met anti-progesteron gecoate, wells van een microtiterplaat. Na incubatie worden de wells gespoeld zodat alleen de gebonden progesteron-moleculen achterblijven. De hoeveelheid gelabeld progesteron is omgekeerd evenredig met de concentratie ongelabeld progesteron in het monster en wordt gemeten door de Alkalische Fosfatase te laten reageren met het substraat para-nitrophenylfosfaat gedurende een tweede incubatie. Het para-nitrophenylfosfaat wordt hierbij omgezet in para-nitrophenol dat een gele kleur heeft. De kleur wordt spectrofotometrisch gemeten bij 405 nm en de concentratie wordt bepaald met behulp van een standaard curve die wordt geconstrueerd met behulp van vier standaard progesteronoplossingen.

Immulie® Plasma

De Ovucheck Plasma is uitgevoerd overeenkomstig de bijgevoegde instructies. De bijgeleverde standaarden van 0,5 1,0 5,0 en 10,0 ng/ml, zowel als de patiëntenmonsters zijn in enkelvoud in de wells gepipetteerd. Nadat 200 Ul conjugaat toegevoegd was is 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Vervolgens zijn de wells  driemaal gespoeld door ze te vullen met water en vervolgens leeg te gieten. Het substraat is vers bereidt door de substraattabletten op te lossen in de bijgeleverde substraatbuffer. Van deze substraatoplossing is 200 ul in de cupjes gepipetteerd en na 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur is de reactie gestopt door 100 ul stopbuffer toe te voegen. Vervolgens zijn de extincties bij 405 nm uitgelezen met behulp van een DAS Elisa strip reader (DAS, scientific instruments, Italy).


De extincties van de standaarden zijn uitgezet op het, bijgeleverde, half-logaritmische, grafiekpapier en verbonden via een rechte lijn. Tenslotte zijn met behulp van deze ijklijn de concentraties van de monsters in de grafiek afgelezen.

Resultaten

De resultaten zijn schematisch weergegeven in tabel 1. De uitslagen van de Immulite® zijn geconverteerd van nmol/l naar ng/ml door de waarden te delen door 3,18.

 

 

OvucheckPlasma ® (ng/ml)

Immulite®

(ng/ml)

1

>10

16

2

4

1,9

3

10

7,7

4

7

3,8

5

4

2,9

6

1

0,6

7

10

7,1

8

>10

13,1

9

5.5

3.6

10

9.5

6.7

11

2.5

1.2

12

6.5

4.9

13

8.8

7.1

14

2

0.6

15

>10

15,0

16

7

3.6

17

4.5

3

18

8.5

5.3

19

<0,5

<0.64

20

<0,5

<0,64

21

3.5

1,9

22

6

4,0

23

<0,5

<0,64

24

<0,5

<0,64

25

<0,5

<0,64

 

Niet alle 25 monsterparen konden gebruikt worden voor de correlatieberekening. Van 3 van de 25 monsters was de uitslag hoger dan het meetbereik van de Ovucheck Plasma (10 ng/ml). De met de Immulite® verkregen concentraties varieerden voor deze monsters van 13,1 tot 16,0.

In 5 van de 25 monsters was de progesteronconcentratie lager dan het meetbereik van de Ovucheck (0,5 ng/ml). Ook voor de Immulite® lagen deze progesteronconcentraties onder het meetbereik (<0,2 ng/ml). De 8 monsters waarin, vanwege het meetbereik, niet met beide methoden een concentratie te bepalen was zijn niet meegenomen in de berekeningen.

 

Het verband tussen de progesteronconcentraties bepaald met de Immulite® (IMM) en met de Ovucheck Plasma® (PP) is berekend met behulp van lineaire regressie (Excel) en wordt weergegeven door de vergelijking: 
 

(IMM)=0,784(PP) – 0,738 (zie grafiek)

 

r = 0,967


Discussie

Omdat de ijklijn van de Ovucheck Plasma® wordt gebaseerd op standaarden van 0,5 tot 10,0 ng/ml is het meetbereik van deze assay, overigens zonder dat daar in de bijsluiter expliciet melding van gemaakt wordt, beperkt tot waarden tussen 0,5 en 10,0 ng/ml. De in de praktijk nogal eens toegepaste extrapolatie, dat wil zeggen het doortrekken van de lijn naar rechts met de bedoeling concentraties hoger dan 10,0 te kunnen meten, is niet betrouwbaar omdat lineariteit boven 10,0 ng/ml. niet wordt vastgesteld.


Omdat bij 8 van de 25 monsters de progesteronconcentratie buiten het meetbereik van de Ovucheck Plasma® vielen zijn deze monsters buiten de berekening gebleven. De overgebleven monsters bleken, met een correlatiecoëfficiënt van 0,967, goed te correleren met de Immulite®. De richtingscoëfficiënt en het intercept, resp. 0,784 en -0,738, geven aan dat de met de Ovucheck Plasma® verkregen waarden wel duidelijk afwijken van de concentraties die bepaald zijn met de Immulite®. Een met de Immulite® bepaalde progesteronconcentratie van 2,0 zal in de Ovucheck 3,5 als resultaat geven terwijl 7,0 met de Immulite 10 als uitkomst zal opleveren met de Ovucheck Plasma®. Uiteraard dient hier bij de interpretatie rekening mee gehouden te worden. De in de literatuur vermelde progesteronconcentraties zijn vaak bepaald met de RIA of met de, hiermee goed overeenkomende chemiluminescentie. Het zal duidelijk zijn dat de hieruit voortkomende adviezen met betrekking tot het optimale tijdstip van dekken of insemineren pas na omrekening met behulp van de in dit onderzoek bepaalde regressielijn toegepast kunnen worden op dieren waarbij het progesteron is gemeten met de Ovucheck®.


Uit een onderzoek van Patricot et al (14) bleek al dat de methode van analyse significante verschillen in progesteronconcentratie kan opleveren. Dit is geen probleem mits de correlatie tussen de methoden maar hoog genoeg is. Met een correlatiecoëfficiënt van 0,967 lijkt voor de Ovucheck Plasma ® aan deze voorwaarde te zijn voldaan.


De conclusie is dan ook gerechtvaardigd dat de Ovucheck® Plasma een bruikbare kit is om in de praktijk de progesteronconcentratie te bepalen. Een kanttekening is daarbij echter op zijn plaats:


De nauwkeurigheid van de Ovucheck® voor het bepalen van de progesteronconcentratie hangt sterk af van de uitvoering, waarbij kennis, ervaring en nauwgezetheid van de uitvoerder een grote rol spelen. Zo zullen bijvoorbeeld fouten bij het pipetteren een grote invloed hebben op de uitkomst. Een punt van zorg in het geval van de Ovucheck® is daarbij dat de bijsluiter aangeeft dat de standaarden en de monsters in enkelvoud gepipetteerd kunnen worden. Door het niet inzetten van duplo’s zullen pipetteerfouten echter onopgemerkt blijven, met mogelijk grote gevolgen voor de betrouwbaarheid.


Een fout bij het pipetteren van één van de standaarden zal aan het licht komen doordat er geen lineaire relatie gevonden zal worden. De uitvoerder zal daaruit dan de conclusie moeten trekken dat de test opnieuw gedaan moet worden. Een kritische beoordeling van de lineariteit van de vier ijkpunten is overigens van groot belang voor de betrouwbaarheid.


Een fout bij het pipetteren van een monster in enkelvoud zal niet aan het licht komen en zal dus een verkeerde uitslag opleveren met mogelijk verstrekkende consequenties. Het verdient om die reden aanbeveling om, in afwijking van de instructies in de bijsluiter, in ieder geval de monsters, in duplo in te zetten.

Literatuur

  1. Feldman, E.C., and Nelson R.W.  In: Canine and Feline endocrinology and reproduction. W.B. Saunders, Philadelphia, 1987; 14: 399 – 417.

  2. Renton, J.P., Boyd, J.S., Eckersall, P.D., Ferguson, J.M., Harvey, M.J. Mullaney, J. and Perry, B. Ovulation, fertilization and early embryonic development in the bitch (Canis familiaris). J Reprod Fertil. 1991 Sep; (1): 221 – 31

  3. Fay, J., Mezo, T., Solti, L., Wofling A. and Abonyi-Toth Z. Comparison of different methods used for oestrus examination in the bitch. Acta Vet Hung. 2003;51(3):385-94

  4. Concannon PW and Lein DH. Hormonal and clinical correlates of ovarian cycles, ovulation, pseudopregnancy and pregnancy in dogs. In Kirk RW, ed. Current Veterinary Therapy, Small Animal Practice, Vol. X. Philadephia: Saunders, 1989; 1269-1282

  5. Jeffcoate IA and Lindsay FE. Ovulation detection and timing of insemination based on hormone concentrations, vaginal cytology and the endoscopic appearance of the vagina in domestic bitches. J Reprd Fertl Suppl. 1989; 39:277-87.

  6. England GCW. Vaginal cytology and cervico vaginal mucus arborisation in the breeding management of bitches. J Small Anim Pract 1992; 33:577-582.

  7. Hegstad RL and Johnston SD. Use of a rapid qualitative ELISA tecnnique (Biometallics Inc) to determine serum progesterone concentrations in the bitch. Proc Soc Theriogenology Annual Meeting, Coeur d”Alene ID, September 29-30, 1989, pp 277-287.

  8. Schaefers-Okkens AC. Estrous cycle and breeding management of the healthy bitch. In; Textbook of Veterinary internal medicine. Ettinger SJ and Feldman  EC ed. 2000; 2: 1510-9

  9. Okkens AC, Dieleman SJ and Vogel F. Determination of the ovulation period in the dog: a comparison of the rapid progesterone assay, vaginoscopy and vaginal cytology. Proceedings Voorjaarsdagen, Royal Netherlands Vet Ass 1985: 26-7

  10. Van Haaften B, Dieleman SJ, Okkens AC and Willemse AH. Timing the mating of dogs on the basis of the blood progesterone concentration. Vet Rec 1989; 125: 526-6

  11. Indirect detection of ovulation and fertilization in the dog by progesterone level testing. Zentralbl Veterinarmed A. 1991 Nov; 38(9): 696-701

  12. Kubasik NP et al. Evaluation of a direct solid-phase radioimmunoassay for progesterone. Clin Chem 1984;30:284-6, 20

  13. Elmlinger MW, Kuhnel W, Ranke MB. Reference ranges for serum concentrations of lutropin (LH), follitropin (FSH), estradiol (E2), prolactin, progesterone, sex hormone-binding globulin (SHBG), dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), cortisol and ferritin in neonates, children and young adults. Clin Chem Lab Med. 2002 Nov;40(11):1151-60.

  14. Patricot MC, Badonnel Y, Boudou P, Lacroix I, Mathian B, Mathieu E, Millot F, Queyrel N, Somma-Delpero C, Taieb J.    Validity of immunochemical methods for bloody progesterone: a study performed in 1998   Ann Biol Clin (Paris). 1999 Mar-Apr;57(2):201-10.

  15. Manothaiudom K, Johnston SD, Hegstad RL and Hardu, SK. Evaluation of the ICAGEN-Target canine ovulation timing diagnostic test in detecting canine plasma progesterone concentrationsJ Am Anim Hosp Assoc. 1995 Jan – Feb;31(1): 57 – 64

  16. van Klaveren, NJ, Kooistra HS, Dieleman SJ, van Lith HA en Schaeffers – Okkens, AC. Een vergelijking tussen de betrouwbaarheid van drie ELISA-testkits en een 125Jodium-radio-immunoassay. Tijdschr Diergeneeskd 2001; 126: 680-5

  17. Hendriks HA, Kortlandt W and WM Verweij. Analytical performance comparison if five new generation immunoassay analyzers. Ned Tijdschr Klin Chem 2000; 25: 170-177.

  18. Wheeler MJ. Automated immunoassay analysers. Ann Clin Biochem 2001; 38: 217-229

  19. Tello FL and Hernandez DM. Performance evaluation of nine hormone ass